بررسی مولکولی ژن پروتئین oapa در سویه های هموفیلوس آنفلوانزا جدا شده از ایران، در راستای طراحی واکسن بومی علیه آن

چکیده: haemophilus influenzae، یک باکتری گرم منفی و پاتوژن اختصاصی انسانی است که از نظر بیماری زایی می تواند ایجاد مننژیت حاد باکتریایی، سپتی سمی، اپی گلوتیت، باکتریمی، عفونت گوش میانی و غیره کند. در درمان آن، ابتدا آنتی بیوتیک ها و سپس واکسن های کنژوگه مورد استفاده قرار گرفت. در طراحی این واکسن ها از پروتئین های حفاظت شده باکتری، به همراه کپسول پلی ساکاریدی استفاده می شود. هدف این مطالعه بررسی یکی از این پروتئین های حفاظت شده در باکتری هموفیلوس آنفلوانزای ایرانی با هدف طراحی واکسن بومی علیه آن می باشد. oapa یک پروتیین آدهزینی است که عامل ایجاد مورفولوژی کلنی شفاف در h. influenzae می باشد. وزن مولکولی آن 47kda بوده و در میان تمامی گونه های h. influenzae حفظ شده است. oapa اتصال میکروارگانیسم به سلول های اپی تلیال در کشت سلولی را تسهیل کرده و یکی از عوامل مهم در کلنی شدن میکروارگانیسم در ناحیه حلقی گلوگاه می باشد و می تواند بعنوان یک کاندیدای مهم در طراحی واکسن علیه عفونتهای h. influenzae مطرح شود. تعداد 14 سویه ی بالینی h. influenzae ها (4 سویه که مربوط به type b h. influenzae و 10 سویه مربوط به nontypeable h. influenzae)، مربوط به بخش های مختلف بدن شامل چشم، نازوفارنکس، خون، csf و bal از بیمارستان میلاد تهیه شد. پس از کشت باکتری ها بر روی شکلات آگار، به منظور تشخیص صحیح h. influenzae، تست های اکسیداز، کاتالاز و نیازمندی به فاکتورهای x و v، انجام شد. سپس جهت تعیین بیوتایپ این سویه ها، تست های ایندول، اوره آز و دکربوکسیلاسیون اسیدآمینه ی اورنیتین صورت گرفت. همچنین به منظور آنالیز مولکولی این ژن، استخراج و تخلیص dna با روش جوشاندن صورت گرفته و سوپرناتانت حاوی dna، جهت واکنش pcr مورد استفاده قرار گرفت. برای این ژن، دو جفت پرایمر اختصاصی طراحی گردید، یکی برای قسمت n-ترمینال ژن و دیگری برای قسمت c-ترمینال. و در نهایت محصولات pcr تعدادی از سویه ها که بطور تصادفی انتخاب شده بودند، جهت تعیین توالی به شرکت های مربوطه ارسال گردید. نتیجه تعیین بیوتایپ سویه ها نشان داد، 29% از سویه ها مربوط به بیوتایپ i، 29% مربوط به بیوتایپ ii، 21.4% مربوط به بیوتایپ iii، 7.14% مربوط به بیوتایپ iv، 7.14% مربوط به بیوتایپ v و 7.14% مربوط به بیوتایپ vii می باشند. نتایج واکنش pcr نیز نشان داد از بین 14 سویه بالینی مورد مطالعه، 11 نمونه دارای باند حدود 800 جفت بازی در ناحیه ی n- ترمینال (نوکلئوتیدهای شماره ی 792-1)، و 3 نمونه ی باقیمانده ها (که همگی مربوط به non typeable h. influenzae)، دارای باند حدود 700 جفت بازی در این ناحیه هستند. و هر 14 سویه در ناحیه ی c-ترمینالشان (نوکلئوتیدهای شماره ی 1295-792) دارای باند حدود 600 جفت باز بودند. یازده سویه ای که در ناحیه ی n-ترمینال خود دارای باند در محدوده ی حدود 800 جفت باز بودند، بسیار شبیه به توالی های نوکلئوتیدی موجود در ncbi بودند، بطوریکه بین 99-95% شباهت مشاهده گردید. برای 3 نمونه ای که از بقیه متفاوت ظاهر شدند و در ناحیه n-ترمینال از ژن دارای باند در محدوده ی حدود 700 بودند، بررسی این توالی در ncbi نشان داد که در هر سه نمونه، یک ناحیه ی حدود 125 نوکلئوتیدی که مابین نوکلئوتیدهای شماره 605 و شماره 731 بوده اند، دچار حذف شده است و لذا وجود باندی با حدود 100 جفت باز کوتاهتر از حد مورد نظر در بررسی pcr ناحیه n-ترمینال، می تواند علت آن باشد. و در کل این ژن در این سویه ها دارای 96-94% تشابه با توالی های ncbi بود. همچنین نتیجه بلاست نواحی c- ترمینال سویه های هموفیلوس آنفلوانزای مورد استفاده در این مطالعه، شباهت 99-95 % را با داده های ncbi نشان داد. لذا پیشنهاد می شود که در تحقیقات آینده، که به منظور طراحی واکسن صورت می گیرد، به دلیل حفاظت شده بودن این ژن در میان تمامی سویه های هموفیلوس آنفلوانزای تیپ b، استفاده از آن مورد توجه قرار گیرد. کلمات کلیدی: haemophilus influenzae، oapa، pcr